0mMNaH2P04,ImMEDTA，0. 5%Triton 父-100，卩117.4;洗涤液的组分：0.511恥(：1，201111似11 2?04,211此6&，0.5%1'1'行〇11父-100， 1禮￡01六，卩117.4 ;溶解液的组分：0.511似(：1，201111恥112?04,501111 11111(^2〇16,811此63，11111 DTT.pH= 7. 4。
[0019] 进一步地，所述Ni Sepharose亲和层析的条件中为：Binding Buffer为0? 5M NaCl，20mM NaH2P04,50mM Imidazole，8M Urea. pH= 7.4;Elution buffer为0.5M NaCl， 20mM NaH2P04,500mM Imidazole，8M Urea. pH= 7. 4。
[0020] 进一步地，所述LB培养基：lOg/L Tryptone，5g/L Yeast Extarct，lOg/L NaCI ; 乳糖诱导培养基：15g/L Tryptone，12g/L Yeast Extarct，3g/L NaH2P04?2H20,7g/L 1(2册04.31120,2.5 §/1恥(：1，0.2%葡萄糖，2.11111乳糖，0.05%]\%504.71120。
[0021] 本发明的有益效果在于：提供了一种鱼精蛋白专用编码基因并揭露了利用该编码 基因制备鱼精蛋白的方法，且该编码基因能够有效的制备所得鱼精蛋白，易于实现鱼精蛋 白的大量获取，且所获得的鱼精蛋白具有很好的抑菌效果。 【【附图说明】】
[0022] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0023] 图1是本发明中pET22b-CYGB-Pro质粒的构建流程图。
[0024] 图2是本发明中pET22b-CYGB-Pro质粒的Nde I、Xho I双酶切鉴定。
[0025] 图3是本发明中融合蛋白CYGB-Pro的Western Blotting分析结果图 (Cytoglobin抗体）。
[0026]图4是融合蛋白CYGB-Pro的Western Blotting分析结果图（His-tag抗体）。 【【具体实施方式】】
[0027] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0028] 以下各实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转 化、酶切等都采用常规的方法。
[0029] 实施例1鱼精蛋白专用编码基因的构建
[0030] 请参阅图1:
[0031] 1. 1 构建质粒pUC57_CYGB-Pro
[0032] 鱼精蛋白（Protamine，Pro)基因由上海生工生物工程有限公司合成，上海生工生 物工程有限公司将合成的鱼精蛋白基因插入PUC57常规克隆载体中，得到pUC57-Pro质粒。
[0033] 用Trizol试剂盒提取H印G2中人细胞球蛋白（Cytoglobin，CYGB)的总RNA，以 提取的总RNA为模板，按照宝生物工程（大连）有限公司的RT-PCR试剂盒操作说明进行 反转录。以RT产物为模板进行CYGB的扩增，选用上游引物5' -AGACATATGGAGAAAGTGCC AGGCGAG-3'（SEQIDN0:2)引入NdeI酶切位点，下游引物 5'-AGAAGATCTCGGCCCCGAAGA GGGCAG-3'（SEQIDN0:3)引入BglII酶切位点，并采用PyrobestDNA聚合酶进行PCR 反应，得目的片段；将PCR反应所得目的片段进行凝胶回收后，用NdeI、BglII双酶切后 插入至所得pUC57-Pro质粒的NdeI/BamHI位点之间，则得克隆载体pUC57-CYGB-Pro; 接着将克隆载体pUC57-CYGB-Pro经42°C热激转化入DH5a感受态中，经酶切法筛选出 克隆载体pUC57-CYGB-Pro成功转入DH5a感受态中的阳性克隆子，阳性克隆子命名为 pUC57-CYGB-Pro质粒。
[0034]其中，PCR反应体系为（体系总体积为 50y1) :ddH2037yl，10XPyrobestBuffer 5yl，5yM上游引物 1.3yl，5yM下游引物 1.3yl，dNTPs4yl，模板质粒pET22b-CYGB lyl，Pyrobest0.3yl。PCR反应程序：94°C预变性 4min;94°C变性 45s，60°C退火 30s， 72°C延伸IminlOs，循环 30 次；72°ClOmin;4°C保存。
[0035]酶切体系（体系总体积为 10y1) : 10XHbuffer1y1 ;pUC57-CYGB-Pro质粒 8. 4y1;NdeI0? 3y1;XhoI0? 3yl〇 酶切条件：37°C水浴 4 ~5h〇
[0036] 1. 2 表达载体pET22b-CYGB_Pro的构建
[0037] 对1. 1所获得的pUC57-CYGB_Pro质粒用NdeI、XhoI酶切后回收小片段，该小片 段命名为CYGB-Pro,经测序其基因序列如SEQIDN0 :1所示，将回收到的小片段CYGB-Pro 插入pET22b载体的NdeI/XhoI位点之间，得表达载体pET22b-CYGB-Pro;将所得表达载 体pET22b-CYGB-Pro经42 °C热激转化入DH5a感受态中，之后通过菌落PCR反应、酶切法鉴 定，筛选出载体pET22b-CYGB-Pro成功转入DH5a感受态中的阳性克隆子，该阳性克隆子命 名为pET22b-CYGB-Pro质粒，委托南京金斯瑞生物科技有限公司对pET22b-CYGB-Pro质粒 进行基因测序，则测序结果与SEQIDN0:1-致，因此，小片段CYGB-Pro即为鱼精蛋白专用 编码基因。
[0038] 其中，PCR反应体系（体系总体积为20y1) :ddH20 14.4y 1、10XPCR 1311打6『2 111、2.5 1^引物丁71111、2.5 1^引物丁7丁61'1111、(1阶131111、丁&1酶0.3 111、模 板0. 3 y 1，且模板为单菌落（即pET22b-CYGB-Pro质粒经42°C热激转化入DH5 a感受态中 所得的单菌落）。PCR反应程序：94°C预变性4min ;94°C变性45s，46°C退火30s，72°C延伸 lmin30s，循环25次；72°C lOmin ;4°C保存。
[0039]上述：引物T7 :TAATACGACTCACTATAGG(SEQIDNO:4);
[0040]引物 17Ter:GCTAGTTAITGCTCAGCGG(SEQIDNO:5)。
[0041] 此外，上述pET22b-CYGB-Pro质粒进行双酶切鉴定（10yl酶切体系：10XH buffer1y1 ;表达载体pET22b-CYGB-Pro8. 4y1;NdeI0? 3y1;XhoI0? 3y1。酶切条 件：37°C水浴4~5h。）的结果如图2所示（图2中，Ml:DL15000 ;1 :双切pET22b;2 :双切 pET22b-CYGB-Pro;M2 :DL2000)，从而说明了pET22b-CYGB-Pro质粒构建以及工程菌构建成 功。
[0042] 实施例2鱼精蛋白专用编码基因制备鱼精蛋白
[0043]利用实施例1构建获得的鱼精蛋白专用编码基因制备鱼精蛋白的方法，其包括如 下具体操作：
[0044] (1)将实施例1构建获得的鱼精蛋白专用编码基因与载体pET22b连接后转化入 BL21 感受态，获得工程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro。
[0045] (2)挑取工程菌BL21-pET22b-CYGB-Pro单菌落并接种入含AmplOOyg/ml的LB培 养基中培养16h，之后按1:100的体积比转入含AmplOOyg/ml的乳糖诱导培养基中，诱导培 养20h，接着于4°C、6000rpm条件下离心20min，然后收集菌体，并置于-80°C下保存。
[0046] (3)将步骤（2)收集到的菌体经-80°C和4°C反复冻融三次裂解菌体，加入破菌液， 且每1克菌体加入10毫升破菌液，并于4°C，lOOOOrpm下离心20min，离心结束后分别收集 沉淀和上清液，融合蛋白CYGB-Pro大部分位于沉淀中；接着采用洗涤液洗涤沉淀两次，之 后