术、放化疗的弊端，已被公认为肿瘤综合治疗模式中最有发展前 途，也是目前唯一有希望完全消灭肿瘤的治疗手段。细胞毒性T细胞（CTL)的免疫功能在 抗肿瘤免疫中起决定作用，肿瘤抗原激活CTL及CTL杀伤肿瘤细胞的前提是CTL对肿瘤抗 原的有效识别，为了增强CTL对肿瘤细胞的免疫应答，多种治疗策略正处于临床试验阶段， 譬如T细胞移植、肿瘤抗原或者DC细胞的免疫。目前常用的肿瘤特异性CTL包括TIL、DC 诱导的CTL及基因修饰的T细胞（TCR-T和CAR-T)，这些技术都具有特异性的杀伤表达该抗 原的肿瘤细胞的功能，是未来细胞免疫治疗的重要发展方向。
[0070] 如图2所示的上述的慢病毒表达载体的制备方法，包括如下步骤：
[0071]S10、设计带有自杀开关的双基因表达盒子Dual_Casp9,并委托合成带有自杀开关 的双基因表达盒子Dual-Casp9,得到含有pUC-Dual-Casp9质粒的大肠杆菌菌液。
[0072] 带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的合成委托商业公司完成，直接获 得含有pUC-Dual_Casp9质粒的大肠杆菌菌液。
[0073]pUC_Dual_Casp9质粒中含有带有自杀开关的双基因表达盒子Dual_Casp9,带有 自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9包括从5'到3'端依次排列的如下结构：第一多克 隆位点-第一弗林蛋白酶切割位点-V5标签-第一Spacer-第一 2A肽-Casp9-第二多克 隆位点，其中，代表连接，Casp9包括从5'到3'端依次排列的如下结构：iCasp9-第二 弗林蛋白酶切割位点-第二Spacer-第二2A肽
[0074]S20、将S10得到的含有pUC-Dual-Casp9质粒的大肠杆菌菌液跟选择性LB液体培 养基混合，在37°C恒温摇床中300rpm培养12h~16h至0D6。。为0. 6~0. 8,将得到的菌液 离心后保留第一沉淀，将第一沉淀裂解后提取pUC-Dual-Casp9质粒。
[0075] 选择性LB液体培养基为含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基。
[0076]S30、在37°C下用AscI内切酶和SalI内切酶处理S20得到的pUC-Dual_Casp9 质粒，充分反应后回收，得到带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段。
[0077]S40、在 37°C下用AscI内切酶和SalI内切酶处理pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE 载体，将pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列切除，充分反应后回收，得到线性化 的pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体。
[0078] pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP. WPRE载体由购自addgene的商业化的pRRLSIN. cPPT. PGK/GFP. WPRE改造而来，将PGK启动子换成了MSCV启动子即可。
[0079]S50、按照摩尔比为3:1将S30得到的带有自杀开关的双基因表达盒子 Dual-Casp9的片段与S40得到的线性化pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体混合，再加入 T4DNA连接酶，4°C下连接过夜，得到含有连接质粒的连接产物。
[0080]S60、将S50得到的含有连接质粒的连接产物转化感受态ToplO大肠杆菌，并均匀 涂布到选择性的LB平板上，37°C倒置培养12h~16h，挑取阳性菌落置于选择性LB液体培 养基中，在37°C恒温摇床中300rpm培养12h~16h至0D6。。为0. 6~0. 8,将得到的菌液离 心后保留第二沉淀，将第二沉淀裂解后提取连接质粒，连接质粒即为慢病毒表达载体。
[0081] 这种慢病毒表达载体的制备方法还包括在得到带有自杀开关的双基因表达盒子 Dual-Casp9的片段之后，在带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段的第一多 克隆位点插入第一目的基因，在带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段的第 二多克隆位点插入第二目的基因的操作。
[0082] 优选的，第一目的基因为小鼠TCRa基因，小鼠TCRa基因的NCBI编号为 DQ452619,第二目的基因为小鼠TCR0基因，小鼠TCR0基因的NCBI编号为DQ452620。
[0083] 一种重组慢病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0084] 提供上述的慢病毒表达载体，并在带有自杀开关的双基因表达盒子Dual_Casp9 的片段的第一多克隆位点插入第一目的基因，在带有自杀开关的双基因表达盒子 Dual-Casp9的片段的第二多克隆位点插入第二目的基因，得到携带有目的基因的慢病毒表 达载体；将携带有目的基因的慢病毒表达载体、pMDLg/pRRE载体、pRSV-Rev载体和pMD-G载 体按照摩尔比为2 :1 :1 :1混合后转染到293FT细胞中，转染后4h~6h更换为完全培养基 培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并将上清用0. 45μm过滤头过滤，保留滤液即为 重组慢病毒的溶液。
[0085] 第一目的基因为小鼠TCRa基因，小鼠TCRa基因的NCBI编号为DQ452619,第二 目的基因为小鼠TCR0基因，小鼠TCR0基因的NCBI编号为DQ452620。
[0086] 在带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段的第一多克隆位点插入第 一目的基因后需要对插入的第一目的基因进行测序，测序引物为：MCSI上游引物和MCSI 下游引物，测序完成后选取测序结果与预期完全相符的载体供下一步使用。
[0087] 在带有自杀开关的双基因表达盒子Dual-Casp9的片段的第二多克隆位点插入第 二目的基因后需要对插入的第二目的基因进行测序，测序引物为：MCSII上游引物和MCS II下游引物，测序完成后选取测序结果与预期完全相符的载体供下一步使用。
[0088]MCSI上游引物的序列如SEQIDNo. 12所示。
[0089]MCSI下游引物的序列如SEQIDNo. 13所示。
[0090]MCSII上游引物的序列如SEQIDNo. 14所示。
[0091]MCSII下游引物的序列如SEQIDNo. 15所示。
[0092]pMDLg/pRRE载体、pRSV-Rev载体和pMD-G载体均为常规的慢病毒组装载体。
[0093] 这种重组慢病毒的制备方法还包括在得到重组慢病毒的溶液后，对重组慢病毒的 溶液的滴度进行检测的步骤，具体为：
[0094] 第一天，将293FT细胞接种到多孔板中，每个孔接种2X105个细胞，每个孔加入 500μL培养基，37 °C、5 %C02培养过夜；
[0095] 第二天，按重组慢病毒的溶液的稀释比例为1、101、ΙΟ2、ΙΟ3、ΙΟ4、ΙΟ5、ΙΟ6、107和108， 用培养基将重组慢病毒的溶液梯度稀释，接着分别将100μL梯度稀释的重组慢病毒的溶 液与100μL多孔板中的细胞培养液在多孔板的不同孔中混合转染，转染开始后24h，吸去 培养基并换成500yL含5UDNasel的新鲜培养基，37°C下培养30min以去除可能附着于细 胞表面的残余质粒DNA，然后将培养基换成lmL正常培养基，继续培养48h;
[0096] 第四天，吸去多孔板的每个孔中的培养基，加入500μL胰酶-EDTA溶液消化细胞， 在37°C反应1分钟，接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔的细 胞，抽提每孔细胞的总RNA，接着逆转录得到每孔细胞的总cDNA;以及
[0097] 以上述的MCSI上游引物和MCSII下游引物分别为上下游引物，按照下表加样， 然后进行荧光定量PCR，获取各孔细胞荧光定量PCR反应的Ct值。
[0098]
[0099] 根据得到的每孔细胞的Ct值，选择与对照组Ct值差异最小但超过2的实验组，得 到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病毒滴度：
[0100]T=RX20X103,其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。
[0101] 一般认为，只要慢病毒滴度达到l〇7TU/mL以上，即认为成功获得所需慢病毒液。
[0102] 具体实施例。具体实施例中使用的质粒为pRRLSIN.cPPT.MSCV改造得到，GFP. WPRE、293FT细胞为市售商品，所使用的试剂均为市售商品。
[0103] 实施例1双基因表达盒的设计
[0104] 双基因表达盒的核心是表达第一 2A肽（SEQIDNo. 8)，在有第一多克隆位点（SEQ IDNo. 3)、第一 2A肽（SEQIDNo. 8)和第二多克隆位点（SEQIDNo. 4)存在的情况下即可 用于实现双外源基因的等量表达。但通过该方式得到的外源基因表达量不高，且在第一 2A 肽上游的多肽序列末端会被加上13个源自第一 2A肽的氨基酸残基，这可能会对该多肽的 特性产生一定的影响。
[0105] 进一步地，在上一步的双基因表达盒的第一多克隆位点和第一 2A肽之间插入第 一Spacer(SEQIDNo. 7)能有效提高外源基因的表达水平。
[0106] 进一步地，在上一步得到的双基因表